25 nmol组可见神经元排列较稀疏,有少量锥体细胞出现形态不规则,核质浓染现象,其HG与3%DMSO+CIP+II组比较无明显差异(P>0.05),但ND略有下降(P
人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)是牙周组织的主要细胞成分,含有不同分化方向和阶段的异质性细胞群体,有合成胶原,吞噬经酶降解的陈旧胶原纤维,形成牙骨质等作用,对牙周组织起作修复和保护的作用,也是牙周组织再生的细胞学基础。 研究表明[1-3]低强度脉冲超声(low intensity pulsed ultrasound ,LIPUS)的刺激可引起细胞膜结构变化,改变K~+等离子的通透性、激活第二信使、影响细胞因子的表达,从而引起骨折愈合的链式反应;可以促进局部血流及淋巴的循环,促进生长因子等骨折愈合关键物质如细胞活素等的运输加强,刺激细胞增殖及细胞外基质合成。 p38MAPK是MAPK家族的重要成员之一,近年来研究发现p38MAPK在骨的代谢中也发挥着重要的作用。PDLCs与成骨细胞具有一定的相似性,我们推测p38MAPK可能参与了PDLCs的分化调控,同时推测p38MAPK也可能参与了LIPUS诱导的PDLCs成骨分化。 因此,本研究在p38MAPK在LIPUS诱导hPDLCs成骨分化的作用机制的探讨具有重要意义。
目的: 1、体外培养hPDLCs。 2、观察SB203580阻断干扰下,LIPUS对hPDLCs合成分泌碱性磷酸酶、骨钙素及钙盐的影响。 3、连续动态观察LIPUS对hPDLCs中p38MAPK活性的影响,为揭示LIPUS对 还有 4、观察SB203580对p38MAPK阻断干扰下,LIPUS对p38MAPK活性的影响,为揭示LIPUS对hPDLCs成骨分化的具体机制提供实验依据。
可能 方法: 1、应用组织块法进行hPDLCs的体外培养,并对其进行形态学的观察、来源鉴定、绘制细胞生长曲线。 2、取第五代人PDLCs接种于六孔板,实验组加入浓度为10μl/L p38MAPK阻断剂SB203580(溶剂为DMSO),对照组、空白组加入浓度为10μl/L DMSO,放入CO_2培养箱培养;置实验组和对照组于六通道LIPUS换能器上进行辐照,20min/d;空白组置于六通道LIPUS换能器进行20min/d、不开电源的假辐照。第11天对各组进行成骨分化期标志蛋白ALP的检测。第15天应用放射免疫法检测检测上清液中骨钙素的含量。第21天进行茜素红染色,检测钙盐的分泌情况。 3、取第五代人PDLCs,消化后接种于六孔板,接种密度为1*104个/ml,1.5ml/孔,设定实验组和对照组,每组3孔细胞,镜下见细胞汇合约60%,饥饿细胞24小时, LIPUS分别辐照0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6h,收集需要检测的细胞,采用western-blot检测磷酸化p38 MAPK(p-p38)及总p38(p38)。4、取第五代人PDLCs,每组3孔细胞,一组加入10μl/L SB203580,另一组加入浓度为10μl/L的DMSO以排除SB203580溶剂DMSO对实验的干扰,饥饿细胞24小时,LIPUS进行辐照,辐照时间选用LIPUS连续辐照时,p-p38强度最高的时间点。收集需要检测的细胞,采用western blotting检测磷酸化p38及总p38。 结果: 1、以90
mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照11天发现,各细胞组上清液和裂解液中ALP含量有差别,且具有统计学意义(F裂解=1207,F上清=334;p0.05)。 5、以90 mW/cm~2-20min/d,LIPUS连续辐照30 min发现(时间点的选择参照2.1实验结果),加入10μl/L SB203580的实验组,p-p38灰度值低于对照组(F=2208.54,P0.05)。 SB431542核磁共振 结论: 1、以90 mW/cm~2、20min/d,LIPUS连续辐照处理0min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6h,进行总p38和p-p38检测,发现30min时p-p38灰度值达峰值。此时间参数为后续实验提供参考。 2、p38MAPK可能参与了LIPUS诱导下的hPDLCs骨向分化,但其具体的作用机制尚需进一步研究。
目的:构建重组小鼠锌α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein )真核表达载体,并稳定转染3T3-L1细胞,观察3T3-L1细胞过表达ZAG后对线粒体生物合成相关因子的影响。 方法:提取正常小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-RCR方法扩增出ZAG序列,克隆入经XbaⅠ和HindШ双酶切后的pcDNA3.1(-),重组小鼠ZAG真核表达质粒(pcDNA3.1(-)-mZAG)经转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,酶切和核苷酸测序鉴定后经脂质体转染3T3-L1细胞,G418筛选阳性克隆扩增,RT-PCR法鉴定ZAG阳性细胞株并检测过氧化物酶增殖型受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1/2(NRF-1/2)、线粒体转录因子A(mtTFA)mRNA表达,Western Blot检测PGC-1α、NRF1/2、mtTFA蛋白的表达。 结果:成功克隆小鼠ZAG cDNA全序列,并将其与pcDNA3.1(-)载体片段连接,构建成pcDNA3.1(-)-mZAG表达质粒。重组真核表达质粒经限制性核酸内切酶XbaⅠ和HindШ酶切后获得5.4kb和924bp两个片段,大小与理论值一致,并由核苷酸序列测定证实。pcDNA3.1(-)-mZAG成功转染3T3-L1细胞,在转染的3T3-L1细胞中ZAG基因的转录明显上调,过表达ZAG后,PGC-1α、NRF-1/2、mtTFA表达均上调。 结论:成功构建ZAG基因的真核表达质粒pcDNA3.