1)通道是钙激活钾离子通道家族中重要一员。近年研究表明：它在T淋巴细胞的激活和增生中发挥重要的功能及在某些肿瘤肿瘤的发生发展中起重要作用，但它与妇科肿瘤发生的关系以及对妇科肿瘤细胞生物学行为影响尚未见报道。本课题从研究钙激活中电导钾离子通道在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中表达入手，利用RNA干扰(RNAi)技术抑制了子宫内膜癌细胞株HEC-1-A中KCa3.1通道的表达，并运用western blot、RT-PCR、流式细胞仪、Real-Time
PCR、氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法、该通道的各种阻断剂，膜片钳技术等研究KCa3.1通道在子宫内膜癌细胞增生和细胞周期中的作用及该通道的电生理特性。 selleck化学药品 本课题共分三部分：①．KCa3.1通道在子宫内膜癌组织中表达；②．子宫内膜癌HEC-1-A细胞KCa3.1通道电生理特性及其对细胞生长的影响；③．KCa3.1通道阻断剂抑制人子宫内膜癌HEC-1-A细胞裸鼠移植瘤生长的研究。 第一部分KCa3.1通道在子宫内膜癌组织中表达 目的检测人的正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中KCa3.1通道的表达，研究它与子宫内膜癌的关系。 方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Real-Time PCR检测正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中KCa3.1通道mRNA的表达，Western blot检测正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中KCa3.1通道蛋白的表达。
结果13例正常子宫内膜标本组织中12例KCa3.1 mRNA弱表达或不表达仅有1例中等表达；而25例子宫内膜癌标本组织几乎都表达KCa3.1 mRNA(RT-PCR的结果和Real-Time Fasudil数据表 PCR结果基本一致)，子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织KCa3.1 mRNA表达差异具有统计学意义(P＜0.01)；13例正常子宫内膜标本组织中11例弱表达或不表达KCa3.1蛋白仅有2例中等表达；而25例子宫内膜癌标本组织几乎都表达KCa3.1蛋白(仅4例KCa3.1蛋白弱表达或不表达)，子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织KCa3.1蛋白表达差异具有统计学意义(P＜0.01)。Western blot和RT-PCR，Real-Time PCR结果基本一致。 结论KCa3.1通道的过表达可能与宫内膜癌的发生发展有关。 第二部分子宫内膜癌HEC-1-A细胞KCa3.1通道电生理特性及其对细胞生长的影响 目的探讨子宫内膜癌HEC-1-A细胞KCa3.1通道电生理特性和KCa3.1通道对子宫内膜癌细胞生长调节作用及其可能机制。 方法选择高表达KCa3.1通道的子宫内膜癌细胞株HEC-1-A和中等表达KCa3.1通道KLE作为研究对象。①利用膜片钳技术探讨不同浓度的、不同种类的阻断剂，不同浓度的钙离子和siRNA技术对HEC-1-A细胞KCa3.1通道电流的影响。②针对KCa3.1通道设计一对特异性siRNA和一对阴性对照(non-sliencing)，用RNAi抑制子宫内膜癌细胞中KCa3.1基因的表达，用FITC标记siRNA的转染效率和Western bloting检测干扰的效率。③采用流式细胞仪，细胞计数和氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入法等方法了解特异性抑制KCa3.1通道的表达和阻断剂阻断KCa3.1通道对HEC-1-A和KLE细胞增生和细胞周期的影响。④在特异性抑制KCa3.1通道的表达和阻滞剂阻断KCa3.1通道条件下，利用western
查找更多 bloting技术检测了与细胞周期密切相关的CyclinDl蛋白的表达，初步探讨KCa3.1通道调节细胞生长的可能机制。 结果①针对KCa3.1通道siRNA抑制了子宫内膜癌HEC-1-A细胞中的KCa3.1通道表达；②采用电压钳模式，在含1 mM Ca~(2+)的电极内液记录条件下，9个细胞静息电位平均值12.5±1.4 mV，细胞处于去极化状态；而用含8.7 mM Ca~(2+)的电极内液刺激下，细胞膜电位为-62.4±1.9 mV，细胞处于超极化状态，说明细胞膜的通透性随细胞内钙离子浓度而改变。在-120 mV to +80 mV指令电压下，每条episode时间为280ms，用含1 mM Ca~(2+)的电极内液刺激下KCa3.1通道电流被诱导出，电流值很小仅为5.5±1.4 pA／pF(n=9)，但在含8.7 mM Ca~(2+)的电极内液刺激下，电流值骤然上升为42.8±5.1 pA／pF(n=15)。在膜电位为+70 mV．，8.7 mM Ca~(2+)的电极内液环境中Clotrimazole，TRAM-34和CTX呈剂量依赖的方式降低HEC-1-A细胞KCa3.1通道电流，针对KCa3.1通道siRNA显著降低HEC-1-A细胞KCa3.1通道电流。③siRNA特异并有效地抑制了HEC-1-A细胞中的KCa3.1通道表达，使细胞增生和氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)参入减少(P＜0.