7和小鼠腹腔巨噬细胞为细胞模型,应用P2Y6受体选择性激动剂(UDP)和阻断剂(MRS2578),通过激活或阻断P2Y6受体相关信号通路,研究P2Y6在固有免疫应答中的调控作用及其分子机制。我们发现P2Y6能够促进巨噬细胞中细胞因子／趋化因子的转录表达,进而达到增强单核／巨噬细胞的趋化迁移作用。具体表现在：一、UDP激活P2Y6可以显著提高巨噬细胞中细胞因子／趋化因子的表达,如MCP-1,

一般 MIP-lα/β, IFN-α/β, TNF-α以及免疫共刺激分子CD80/86的转录表达；二、UDP刺激巨噬细胞后,其培养上清能明显引起单核细胞／巨噬细胞的趋化迁移,而这种作用能够被P2Y6选择性抑制剂MRS2578所抑制；三、UDP激活P2Y6后可以显著增强巨噬细胞RAW264.7的迁移能力。 在此基础上,我们对P2Y6所参与调控巨噬细胞的信号通路进行了系统分析。Western blot结果显示P2Y6的激活能显著提高MEKl/2、PI3K、STAT1以及IRF3等的磷酸化水平,但对Src和IKK却没有明显作用；磷酸化MEKl/2明显激活ERKl/2通路,而P38及JNK没有显著性变化。应用MAPKs信号通路的专一性抑制剂,如MEK1/2的U0126和PD9805,结合荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay)及EMSA技术,发现P2Y6主要通过激活MEKl/2-ERK1/2-AP1相关信号通路,从转录水平上调控了趋化因子MCP-1的表达。此外,P2Y6的激活通过提高IRF3和STAT1磷酸化水平,显著性上调了Ⅰ型干扰素IFN-α/β等的转录表达,这些结果提示P2Y6受体在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。 最后,我们通过MCP-1中和抗体实验和小鼠空气泡模型(Air pouch model),进一步确认了P2Y6通过上调趋化因子MCP-1的表达,进而在体内外调控单核／巨噬细胞招募的作用。同时,我们应用GFP标记的E.coil成功建立小鼠腹膜炎模型(Peritonitis),结果表明UDP通过激活P2Y6不仅可以提高局部感染组织对单核／巨噬细胞的招募,还能够显著增强小鼠清除病原体的能力,提高了小鼠的存活率。

综上所述,嘌呤受体P2Y6能够通过MEKl/2-ERKl/2-AP1信号通路的激活,显著提高巨噬细胞中MCP-1等趋化因子的转录表达,在体内提高了单核／巨噬细胞的招募作用,最终达到增强机体抗感染能力,提高宿主存活的目的。本论文的研究为基于G蛋白偶联受体P2Y6的免疫调控药物的开发打下了良好的理论基础。
第一部分:TEA和4-AP敏感型钾通道参与由gp120引起的海马神经元的凋亡 虽然HIV病毒壳蛋白gp120对神经元的损伤作用在HIV相关性痴呆(HIV-associated demential,HAD)发展的过程中起到重要作用,但致其损伤的作用靶点仍未明确。因此,明确gp120引起中枢神经系统神经元损伤的作用靶点对于HAD的防治显得尤为重要。近期有报道称,钾通道可能是引起HAD的又一靶点,因为持续性的钾离子外流会引起细胞凋亡。因而,该实验中,通过运用全细胞膜片钳的实验方法,我们发现gp120能显著引起外向钾电流的增高,且呈明显的浓度依赖性。实验进一步表明,TEA和4-AP敏感型钾通道均参与gp120引起的钾电流增大,这一结果与MTT和TUNEL实验中,TEA和4-AP能有效阻断gp120引起海马神经元的毒性一致。以上结果表明:gp120引起TEA和4-AP敏感型钾电流的增大,促发钾离子的外流,最终导致神经元的凋亡。 并且 第二部分:4-AP敏感型钾电流参与由甲基苯丙胺引起的海马神经元的凋亡 甲基苯丙胺(Methamphetamine,Meth)是目前广泛滥用的一种非法精神兴奋剂。Meth的滥用可引起神经元的损伤,例如皮层灰质的缺失,海马神经元的萎缩,但其机制仍不清楚。细胞体积与胞内钾离子的稳态密切相关,持续性的钾离子外流可引起细胞凋亡性体积缩小。该实验中,我们以原代培养胚胎大鼠的海马神经元作为研究对象,探索由Meth引起的神经元损伤与钾通道之间的关系。利用全细胞膜片钳的方法,我们发现,Meth能明显增加4-AP敏感型钾电流的电流密度,而对TEA敏感型钾通道作用不明显。与此结果一致的是,利用MTT和TUNEL的方法,我们发现4-AP能够部分阻断Meth引起的海马神经元的毒性作用。进一步研究表明,Meth增大4-AP敏感型钾电流可能是通过抑制ERK通路的磷酸化来实现的。

Protease Inhibitor Library 这些结果表明,Meth可能通过抑制ERK的磷酸化引起4-AP敏感型钾电流的增大,最终导致海马神经元的损伤。 第三部分甲基苯丙胺与gp120对海马神经元的综合作用 毒品的滥用是神经退行性疾病的重要危险因素,同时也是HIV感染的主要途径之一。毒品和HIV病毒的共同作用可能会造成更为严重的神经系统的损伤,加快HAD的发展。甲基苯丙胺(Meth)是目前最常见,使用最为广泛的毒品之一,研究表明,Meth对中枢神经系统有直接的毒性作用,可引起海马的皱缩,胶质细胞的激活等。基于第一部分gp120及第二部分Meth对海马神经元的损伤作用,我们推测,gp120可能会与Meth对神经元产生相加或协同的毒性作用,引起更为严重的细胞损伤。因此,我们利用全细胞膜片钳,MTT和TUNEL的实验方法,初步探索了gp120+Meth处理组与gp120或Meth单独处理组引起的海马神经元的损伤,但在该实验中,我们并未到观察到HIV病毒蛋白gp120与Meth对海马神经元的综合作用,其原因值得进一步探索。
近年来越来越多的证据提示,高糖介导的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶活性增高引起的氧化应激反应对糖尿病微血管并发症的病情发展起着重要作用。NADPH氧化酶最初在吞噬细胞中发现,近年来的研究显示,许多非吞噬细胞中的NADPH氧化酶是活性氧(ROS)的主要来源,尤其在细胞因子、高糖、高脂等作用下可以产生更高水平的ROS。白藜芦醇(Resveratrol)是一种常见于葡萄、虎杖等植物中的一种多酚类化合物,目前的研究显示它具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及延缓衰老等多种药理功能。糖尿病动物模型显示白藜芦醇对糖尿病微血管并发症有显著的保护作用。但白藜芦醇对高糖介导的肾小球系膜细胞NADPH氧化酶的激活和ROS的产生是否有保护作用仍不清楚。本课题在体外和体内水平研究了白藜芦醇在高糖所致肾小球系膜细胞损伤中的保护作用以及对NADPH氧化酶的影响。 我们在标准糖浓度下(5.