建立体外多巴胺诱导的黑素细胞氧化应激凋亡模型。2.对文献报道的6种具有抗氧化抗凋亡的中药成分,利用多巴胺诱导黑素细胞凋亡的体外模型,检测其对氧化应激引起的黑素细胞凋亡的保护作用。3.探讨其中对黑素细胞有保护作用的中药成分(芹黄素)对多巴胺引起的氧化应激及相关的c-Jun氨基端激酶(c-Jun

LY2835219数据表 N-terminal Kinase,JNK)、p38和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)信号转导通路的影响,初步探讨其作用机制。 方法:1.采用健康儿童包皮组织原代培养获得黑素细胞,免疫细胞化学法检测S-100蛋白,进行细胞鉴定。MTT法检测不同浓度及作用时间的多巴胺对黑素细胞活力的影响。通过Annexin-V/PI双染流式细胞术凋亡细胞比例检测及Western Blot法检测caspase3和多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)的活化,观察多巴胺对黑素细胞凋亡的影响。DCFH-DA(2’,7’-dichloro?uorescin diacetate)法流式细胞术检测多巴胺对黑素细胞活性氧分子(ROS)生成的影响。2. MTT法检测芹黄素等6种中药成分预处理对多巴胺引起的黑素细胞活力降低的影响。采用Annexin-V/PI双染流式细胞术检测这6种中药成分对多巴胺诱导的黑素细胞凋亡的影响。3. Western Blot法检测筛选出的有效中药成分(芹黄素)对多巴胺引起的caspase3和PARP的活化的影响。DCFH-DA法流式细胞术检测芹黄素对多巴胺诱导的黑素细胞活性氧分子(ROS)生成的影响。4. Western Blot法检测多巴胺对黑素细胞的p38、JNK及Akt信号通路的影响。Annexin-V/PI双染流式细胞术检测p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、Akt抑制剂LY294002预处理黑素细胞对多巴胺促凋亡作用的影响。Western

Blot法检测芹黄素预处理对多巴胺激活的p38、JNK及Akt信号通路的影响。 结果: 1.多巴胺诱导的体外黑素细胞氧化应激凋亡模型的建立 原代培养纯化的黑素细胞,显现出黑素细胞的明显特征, S-100免疫细胞化学鉴定证实为高纯度黑素细胞。多巴胺可呈浓度依赖性和时间依赖性抑制黑素细胞活力。500μM多巴胺作用于黑素细胞12h,细胞活力下降约50%。Annexin-V/PI双染流式细胞术结果显示,不同浓度多巴胺作用于黑素细胞12h,可呈浓度依赖性增加凋亡细胞比例。Western AUY922 Blot结果显示,500μM多巴胺作用黑素细胞6h或12h,caspase3和PARP出现明显活化,12h组活化的PARP和caspase 3蛋白含量高于6h组。DCFH-DA法流式细胞术结果显示,多巴胺可明显增加黑素细胞ROS含量。以上结果表明500μM多巴胺作用于黑素细胞12h可明显诱导黑素细胞氧化应激和凋亡。 2.抑制黑素细胞凋亡的抗氧化中药成分筛选 根据文献报道选出具有抗氧化和抗凋亡作用的芹黄素、芍药苷、葛根素、麦角甾苷、人参皂甙Rb1和姜黄素6味中药成分。结果发现,不同浓度的6味中药成分预处理黑素细胞后,芹黄素可明显抑制多巴胺诱导的黑素细胞活力降低,减少多巴胺诱导的黑素细胞凋亡。其他中药成分在实验浓度下对黑素细胞活力和凋亡均无明显影响。

3.芹黄素对多巴胺诱导的黑素细胞氧化应激及凋亡的影响 0.3~10μM的芹黄素可呈浓度依赖性的抑制多巴胺引起的黑素细胞活力降低的作用,减少凋亡细胞比例。芹黄素预处理可降低多巴胺对PARP和caspase 3的活化,抑制多巴胺诱导的ROS生成。 4.芹黄素对黑素细胞氧化应激相关的凋亡信号通路的影响 500μM多巴胺作用于黑素细胞,p38、JNK及Akt的磷酸化蛋白含量均呈时间依赖性增加。p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125、Akt抑制剂LY294002预处理,可明显减少多巴胺诱导的Annexin-V阳性细胞比例,证实多巴胺的促黑素细胞凋亡机制有赖于p38、JNK及Akt信号通路。而芹黄素预处理可明显抑制多巴胺激活的p38、JNK及Akt的磷酸化,说明p38、JNK、Akt信号通路参与了芹黄素的抗多巴胺诱导的黑素细胞凋亡的机制。 selleck抑制剂 结论: 1. 500μM多巴胺作用于黑素细胞12h可明显诱导黑素细胞氧化应激和凋亡。 2.芹黄素可抑制多巴胺诱导的黑素细胞ROS生成,减少黑素细胞凋亡。芍药苷、葛根素、麦角甾苷、人参皂甙Rb1、姜黄素在实验浓度范围内对多巴胺诱导的黑素细胞活力降低和凋亡无明显保护作用。 3.多巴胺的促黑素细胞凋亡作用有赖于p38、JNK、Akt信号通路的激活。p38、JNK、Akt信号通路参与了芹黄素的抗多巴胺诱导的黑素细胞凋亡的机制。
葡萄糖是乳汁合成的主要前体物质之一,与乳产量和乳品质密切相关。本研究围绕奶牛乳腺上皮细胞葡萄糖摄取的调控及其对乳成分合成的影响展开了以下研究：首先建立了泌乳奶牛乳腺上皮细胞模型；其次分别研究了泌乳相关激素和单糖基质对葡萄糖转运载体基因表达和葡萄糖摄取的影响；最后探讨了葡萄糖供应量对主要乳成分(乳脂和乳糖)合成的影响及其可能机制。主要研究结果如下： 1.泌乳奶牛乳腺上皮细胞模型建立及其功能检测 该部分旨在建立奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型。试验选择DMEM/F-12培养液,用组织块培养法得到奶牛乳腺上皮细胞。为维持乳腺细胞的泌乳功能,在培养体系中添加了催乳素、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白等成分。根据乳腺上皮细胞和成纤维细胞对胰酶敏感度的不同,采用0.25%胰酶和0.15%胰酶加0.02%EDTA反复酶差消化,得到较为纯化的乳腺上皮样细胞。培养细胞呈单层、鹅卵石样铺展,可形成腺泡和岛屿状结构,具有上皮细胞的典型形态特征。此外,通过乳腺上皮细胞特征性细胞角蛋白18免疫细胞化学鉴定和细胞生长曲线分析,证明培养得到的细胞是正常乳腺上皮细胞。研究发现细胞传至第10代,细胞依然生长旺盛。通过细胞亚显微结构观察、乳脂形态观察、αsl酪蛋白基因表达、酪蛋白Western-blot含量检测等方法检测乳腺细胞的泌乳功能,证明培养至第10代的乳腺上皮细胞仍具有乳汁合成和分泌功能,表明本研究建立的奶牛乳腺上皮细胞培养模型可作为乳腺生理相关功能研究的模型。 2.泌乳相关激素对乳腺细胞主要葡萄糖转运载体基因表达的影响及相关信号通路研究 该部分研究了泌乳相关激素(催乳素、胰岛素和氢化可的松)单独及组合作用对GLUT1和GLUT8基因表达的影响,探讨了胰岛素调控GLUT8基因表达和葡萄糖摄取的相关信号通路。结果发现,不同浓度催乳素和胰岛素对GLUT1基因表达均无显著影响(P>0.05),高剂量催乳素可显著降低GLUT8基因表达(P<0.