明确脓毒症中是否存在组蛋白释放入血； 2.探讨组蛋白是否促进淋巴细胞凋亡及作用强度； 3.探讨组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的机制； 4.探讨组蛋白抗体能否减轻脓毒症引起的淋巴细胞凋亡。

研究方法 1.检测脓毒症小鼠模型外周血中组蛋白H4的表达 a)动物分组 选取雄性C57小鼠18只(8-12周龄),随机分配至三大组：正常对照组,假手术组(sham组),脓毒症模型组(CLP组)。其中,正常对照组不做任何处理；sham组只打开腹腔,找到盲肠后再置入腹腔,关闭腹腔；脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术(Cecal Ligation and Puncture, CLP)。于25℃室温下观察6小时,眼球取血约1mL,至肝素抗凝管,摇匀,分离血浆和淋巴细胞,采用western blot和流式细胞技术分别检测血浆中组蛋白H4和淋巴细胞凋亡率实验重复三次。 b)脓毒症模型建立 小鼠麻醉后固定,备皮,延腹中线切开皮肤,腹白线切开腹膜,腹腔内找到盲肠,于距盲肠末端1/3处结扎,使用21G针头穿孔,盲肠置回腹腔,关闭腹腔,缝合。将术后小鼠放入室温25℃的环境下观察、麻醉苏醒。 c)外周血组蛋白H4检测 0.7mL全血离心后留取血浆,稀释5倍,加Loading Buffer变性、离心,放于-20℃保存。BCA蛋白定量检测各组总蛋白浓度,确定各组总蛋白的上样量,检测各组组蛋白H4的表达量。 d)动物淋巴细胞凋亡率检测 应用密度梯度分离法分离淋巴细胞,nnexinV-FITC/PI避光染色10min,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。 2.组蛋白促进淋巴细胞凋亡及其作用强度 a)细胞分组 淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞细胞分离步骤,培养于1640培养液中。(1)组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的浓度依赖性：淋巴细胞分为4大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,分别与组蛋白Oug/mL Pifithrin-α溶解度 有 (对照组)、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL于37℃培养箱中培养2h,等量1640培养基做对照。(2)组蛋白诱导淋巴细胞凋亡的时间依赖性：淋巴细胞分为3大组,每组3管,每管2.5×105个细胞,组蛋白100ug/mL,在37℃培养箱中培养0h(对照组)、2h、3h,等体积1640培养基做对照。 b)人血淋巴细胞的提取 抽取健康志愿者静脉血20mL,肝素抗凝,均分为5管,血液：PBS=1：1稀释血液,混匀后分别加入装有4m1淋巴细胞分离液的离心管上层,于25℃离心机1200g离心30min,吸取中间白膜层(富淋巴细胞),经PBS洗涤离心后,用1640培养基重悬所有淋巴细胞至同一EP管中,计数备用。c)人血淋巴细胞凋亡的检测

将处理好的淋巴细胞250g离心5min,弃上清,加入1mL PBS,重悬,离心,弃上清,AnnexinV-FITC/PI避光染色10min, PBS重悬细胞,流式细胞仪分别检测每管的淋巴细胞凋亡率。 d)动物分组 选取雄性C57小鼠20只(8-12周龄),14只用于生存时间研究,随机分配至两大组：正常对照组和组蛋白组,组蛋白组小鼠经尾静脉注射组蛋白75mg/kg,对照组尾静脉注射同等体积的PBS,观察2小时内小鼠的生存情况。6只小鼠用于淋巴细胞凋亡检测,随机分配至两组：组蛋白组和对照组,组蛋白组小鼠经尾静脉注射组蛋白60mg/kg,对照组尾静脉注射同等体积的PBS,观察6h,眼球取血0.1mL,用于淋巴细胞检测。

e)动物淋巴细胞的检测 应用密度梯度分离法分离淋巴细胞,AnnexinV-FITC/PI避光染色10min,流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率。 3.组蛋白通过作用于线粒体途径和MAPKp38诱导淋巴细胞凋亡 a)细胞分组 淋巴细胞来源于健康志愿者全血,经淋巴细胞分离后,培养于1640培养液中。(1)线粒体膜损伤检测：淋巴细胞分为5大组,每组3管,每管细胞2.5×105个,分别与组蛋白0ug/mL(对照组)、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL于37℃培养箱中培养2h,等量1640培养基做对照。(2)凋亡相关蛋白检测：淋巴细胞分为3大组,每组3管,每管细胞10×105个/mL,分别与组蛋白Oug/mL(对照组)、50ug/mL、100ug/mL在37℃培养箱中培养2h,等体积1640培养基做对照。 Hormones antagonist b)人血淋巴细胞的提取 具体方法同前。 c)线粒体膜损伤检测 将处理好的细胞离心弃去上清,加入Rhodamine123染色剂0.5ug/ml,于37℃孵育0.5h,流式细胞仪检测线粒体膜损伤程度。d)线粒体膜蛋白Bcl-2检测 将处理好的细胞250g离心10min, PBS lml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组Bcl-2的表达。e)细胞信号通路p38活化 将处理好的细胞250g离心1(min, PBS lml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组磷酸化的p38的量。f) Caspase3活化检测 将处理好的细胞250g离心10mmin,PBS1ml分别洗涤,再离心弃去上清,加入细胞裂解液,提取蛋白,变性后存储于-20℃。以GAPDH为参照蛋白行免疫印迹(western blot)检测,确定各组总蛋白量基本一致的上样量,行westernblot检测各组蛋白浓度组Caspase3的活化。4.